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細胞培養(yǎng):如何培養(yǎng)骨髓巨噬細胞

發(fā)布時間:2024-12-12     發(fā)布作者:上海通蔚生物

  巨噬細胞是適應性免疫系統(tǒng)的關鍵細胞,與許多疾病有關??梢允褂镁奘杉毎麡蛹毎担ㄈ缧∈?/span>RAW264.7系)在體外研究它們。然而,細胞系是永生化的,通常不能反映細胞的典型功能??梢詮男∈蠊撬柚刑崛『团囵B(yǎng)原代巨噬細胞,并將其分化為骨髓衍生巨噬細胞(BMDM)BMDM代表了巨噬細胞功能的更準確模型。由于原代細胞可能難以處理,我們整理了一些實驗技巧。



  以下是成功提取和培養(yǎng)BMDM技巧


  1.保持清潔。在切割骨頭邊緣之前,去除所有組織并用70%乙醇徹底清潔骨頭,以避免骨髓受到污染。骨頭的外部不是無菌的,這可能會污染下游培養(yǎng)物。還建議用青霉素/鏈霉素補充骨髓培養(yǎng)基,以進一步降低污染風險。如果可能,請在無菌環(huán)境中進行提取。骨頭外部的細胞最終可能會進入骨髓提取物中并長出巨噬細胞前體。


  2.制作單細胞懸浮液。使用針頭和注射器分離細胞團塊。骨髓可能會以大細胞團塊的形式被沖洗出來,但可以用針頭上下沖洗來分解這些細胞團塊,以制作單細胞懸浮液。一旦去除細胞團塊,還應使用70uM細胞過濾器過濾細胞懸浮液以去除骨碎片。


  3.從骨髓中裂解紅細胞。這將濃縮您的樣本中的巨噬細胞前體并增加您的BMDM產(chǎn)量。


  4.細胞密度很重要。在進行分化之前,使用傳統(tǒng)血球計數(shù)器和顯微鏡對骨髓細胞進行計數(shù)和檢查其活力。骨髓細胞非常小,自動細胞計數(shù)器可能無法準確計數(shù)細胞濃度。骨髓細胞對其細胞密度很敏感:目標是1x10 6個細胞/毫升。


  5.使用合適的塑料。在非組織培養(yǎng)涂層塑料(無菌細菌培養(yǎng)皿)上分化巨噬細胞。否則它們會變得過于粘附,您可能無法將它們拆下重新接種用于實驗。


  6.堅持嚴格的細胞喂養(yǎng)。BMDM培養(yǎng)基必須含有巨噬細胞集落刺激因子( M-CSF )–可以使用重組形式的蛋白質(10ng/mL)或來自自然分泌該蛋白質的鼠成纖維細胞L929的條件培養(yǎng)基(培養(yǎng)基的20%v/v)。提取后第4天,向培養(yǎng)物中添加等量的新鮮培養(yǎng)基,從而使培養(yǎng)基體積加倍。逐滴添加以免擾亂細胞。提取后第7天,巨噬細胞將分化,現(xiàn)在可以分離并重新接種用于實驗。此后必須每48小時更新50%的培養(yǎng)基以保持細胞活力。不要完全更換培養(yǎng)基,因為原代細胞對其分泌的自分泌因子很敏感。


  7.不要擾早期培養(yǎng)。雖然在提取后的幾天內檢查細胞可能很誘人,但在前4天內不要觸摸培養(yǎng)皿,以讓細胞附著。


8. 時機很重要。BMDM將在提取后7天分化。實驗(包括巨噬細胞極化(如果需要))應從此時開始,持續(xù)時間不超過一周。此后,細胞可能不再代表巨噬細胞表型和基因型。


上述通蔚為大家介紹了如何培養(yǎng)骨髓巨噬細胞及成功提取和培養(yǎng)BMDM技巧。希望上述內容對您培養(yǎng)巨噬細胞有所幫助。


  

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