骨髓單細(xì)胞懸液的制備方法

小動物骨髓的采集：

1. 處死動物，無菌提取股骨和脛骨，剪去兩端軟骨，露出紅色的骨髓腔（注意盡可能少的剪走骨髓腔）。

2. 取1ml的無菌注射器，吸取少量的含有10%標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清的稀釋液或者是含有血清的培養(yǎng)基，沖洗骨髓腔以獲得骨髓。

3. 終制備成2×108–1×109/ml 的單細(xì)胞懸液備用。

大動物骨髓的采集：

大動物骨髓的采集可采取活體穿刺方法：先將動物麻醉、固定、局部除毛、消毒皮膚，然后估計好皮膚到骨髓的距離，把骨髓穿刺針的長度固定好。操作人員用左手把穿刺點周圍的皮膚繃緊，右手將穿刺針在穿刺點垂直刺入，輕輕左右旋轉(zhuǎn)將穿刺針鉆入，當(dāng)穿刺針進(jìn)入骨髓腔時常有落空感。連接注射器緩慢抽吸骨髓組織，當(dāng)注射器內(nèi)抽到少許骨髓時即停止抽吸。用含10%標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清的稀釋液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×108–1×109/ml 的單細(xì)胞懸液備用。

常用的骨髓穿刺點：

股骨：穿刺部位在股骨內(nèi)側(cè)面,靠下端的凹面處；

胸骨：穿刺部位是胸骨體與胸骨柄連接處；

肋骨：穿刺部位是第5～7肋骨各點的中點；

脛骨：穿刺部位是股骨內(nèi)側(cè)、靠下端的凹面處。如果穿刺采用的是肋骨，穿刺結(jié)束后要用膠布封貼穿刺孔，防止發(fā)生氣胸。

注意事項：

A. 開封顛倒混勻，本分離液為無菌產(chǎn)品，為延長分離液保存時間，請在無菌條件下啟封，避免微生物污染。。

B. 分離液使用時應(yīng)始終保持室溫（18℃~25℃），如室內(nèi)溫度較低，可將分離液預(yù)熱。4℃或者是溫度較低的條件下離心，可能會導(dǎo)致白膜層中紅細(xì)胞污染加重。

C. 洗滌細(xì)胞，不可使用含Ca、Mg離子的緩沖液及培養(yǎng)液，其成分會導(dǎo)致血細(xì)胞凝集，大大降低細(xì)胞得率及純度。

D. 部分塑料制品（如聚苯乙烯）因其帶有的靜電作用，可能會導(dǎo)致細(xì)胞掛壁，影響分離效果。

E. 如果要進(jìn)一步對分離的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，那在收集血液和分離過程中，注意無菌操作，避免微生物污染。

F. 不同動物血液在不同比重分離液中的細(xì)胞離散系數(shù)及細(xì)胞帶電不同，用戶在制定分離液時應(yīng)提供所需分離液的比重、動物種屬及被分離細(xì)胞的名稱。