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    品質(zhì)保證 · 通蔚試劑

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    產(chǎn)品中心

    • 金銀花探針法PCR鑒定試劑盒

      規(guī)格：
      數(shù)量：

      購買數(shù)量

      • 品牌 : 通蔚生物
      • 目錄號 : TW40322
      • 應(yīng)用 : 僅供科研使用
      • 保存條件 : 低溫/避光保存
      • 貨期 : 現(xiàn)貨
      • 商品庫存：100
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    產(chǎn)品及特點：
    1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。
    2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高。
    3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。
    4. 特異性高，引物是根據(jù)金銀花高度保守區(qū)設(shè)計，不會跟其他病毒 DNA發(fā)生交叉反應(yīng)。
    5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應(yīng)。
    規(guī)格及成分：

    編號

    成分

    規(guī)格

    試劑一

    2×Probe qPCR MagicMix

    500μL(本色蓋)

    試劑三

    熒光PCR專用模板稀釋液

    1 mL(黃蓋)

    試劑二

    金銀花qPCR引物混合液

    100μL(白蓋)

    試劑四

    金銀花qPCR探針

    50μL(棕色管)

    試劑五

    金銀花探針法qPCR陽性對照(1×10E8/μL)

    50μL(紅蓋)

     

    使用手冊

    1 份

    運輸及保存：
    低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。
    自備試劑：
    樣品DNA。
    使用方法：
    一、稀釋標準曲線樣品(以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例)：
    由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。
    1. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
    2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。
    3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
    4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
    5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。
    6. 放冰上待用。重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
    二、樣品DNA的制備： 
    7. 如果有 N 個樣品，最好設(shè)置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）。可以用 10μL 陽性對照的 10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為 NC。
    8. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù) DNA 提取試劑盒兼容。
    三、Probe qPCR反應(yīng)(20μL體系，在樣品制備室進行)：
    9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標記 N+4 個 PCR管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
    10. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：

    成份

    N+2個樣品管

    PCR陰性對照管

    標準曲線樣品管2-7管

    2×ProbeqPCRMagicMix

    10μL

    10μL

    各10μL

    金銀花qPCR探針

    1μL

    1μL

    各1μL

    金銀花探針法qPCR引物混合液

    2μL

    2μL

    各2μL

    N+2個待測DNA模板

    7μL

    --

    --

    超純水

    --

    7μL

    --

    第7步所得標準曲線樣品稀釋液2-7號

    --

    --

    各7μL2號樣到2號管,3號樣到3號管

    11. 蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行PCR：

    過程

    溫度

    時間

    預(yù)變性

    95℃

    3 min

    PCR反應(yīng)40個循環(huán)

    95℃

    15 sec

    60℃

    1 min(采集FAM通道的熒光信號)

    四、數(shù)據(jù)處理：
    12. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 RNA濃度的 log 值，再推算出其濃度。
    13. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。若重復(fù)結(jié)果 Ct值小于 40，擴增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性，否則為陰性。 
    五、特別提示：
    本公司的所有產(chǎn)品，僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！
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